檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證
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檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證包括方案的起草及審批，檢測儀器的確認(rèn)，適用性驗(yàn)證（包括準(zhǔn)確度試驗(yàn)、精密度測定、線性范圍試驗(yàn)、專屬性試驗(yàn)等）和結(jié)果評(píng)價(jià)及批準(zhǔn)四個(gè)的方面。今天和家一起學(xué)習(xí)這4個(gè)方面的注意事項(xiàng)及檢出限的詳細(xì)計(jì)算方法。
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檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的基本步驟
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首先是制定驗(yàn)證方案，然后對(duì)大型精密儀器進(jìn)行確認(rèn)，最關(guān)鍵的一步是檢驗(yàn)方法的適用性試驗(yàn)，最后是檢驗(yàn)方法評(píng)價(jià)及批準(zhǔn)。
1、驗(yàn)證方案的制定
檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證方案通常由質(zhì)量驗(yàn)證小組提出。根據(jù)產(chǎn)品的工藝條件、原輔料化學(xué)結(jié)構(gòu)、中間體、分解產(chǎn)物查閱有關(guān)資料，提出規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，確定檢查項(xiàng)目，規(guī)定雜質(zhì)限度，即為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。
根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案確定檢查和試驗(yàn)范圍，對(duì)檢驗(yàn)方法擬定具體操作步驟，最后經(jīng)有關(guān)人員審批方可實(shí)施。
2、大型精密儀器的確認(rèn)
分析測試中所用的檢測儀器一般可分為三類：
A、普通儀器：
崩解儀，折光儀、分析天平、酸度計(jì)、溶點(diǎn)測定儀、電導(dǎo)儀等；
B、較精密儀器：
旋光儀、永停滴定儀、費(fèi)休氏水分測定儀、 自動(dòng)滴定儀、藥物溶出度儀、可見分光光度計(jì)、電泳儀等；
C、大型精密儀器：
紫外分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)、氣相色譜儀、高效液相色譜儀、薄層掃描儀等。
為了保證分析測試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，每臺(tái)檢測儀器在投入正式使用之前都應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)。
檢測儀器的確認(rèn)是檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的基礎(chǔ)，應(yīng)在其它驗(yàn)證試驗(yàn)開始之前首先完成。
檢測儀器確認(rèn)工作內(nèi)容應(yīng)根據(jù)儀器類型。技術(shù)性能而定，通常包括：安裝確認(rèn)、校正、適用性預(yù)試驗(yàn)和再確認(rèn)。
3、校正
校正是儀器確認(rèn)及檢驗(yàn)方法驗(yàn)證中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，應(yīng)當(dāng)在驗(yàn)證試驗(yàn)以前進(jìn)行校正。紫外分光光度計(jì)校正包括波長校正、吸收度測試、準(zhǔn)確度測試、雜散光檢查。
氣相色譜儀與高效液相色譜儀均要求做系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。在規(guī)定的色譜條件下測定色譜柱的最小理論塔板數(shù)。分離度和拖尾因子，并規(guī)定變異系數(shù)應(yīng)不大于2％。
對(duì)于化學(xué)檢驗(yàn)中使用的計(jì)量儀器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均應(yīng)校正。
4、適用性預(yù)試驗(yàn)
儀器的安裝確認(rèn)完成以后，在其功能試驗(yàn)符合要求的情況下，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穼?duì)其進(jìn)行適用性檢查，以確認(rèn)儀器是否符合使用要求。
例如對(duì)熔點(diǎn)測定儀的適用性預(yù)試驗(yàn)是采用已知溶點(diǎn)的甲硝唑做試驗(yàn)，測試結(jié)果與已知熔點(diǎn)比較。
紫外分光光度計(jì)可用已知含量的某標(biāo)準(zhǔn)品試驗(yàn)，測得結(jié)果與已知數(shù)值對(duì)比，確定儀器是否符合使用要求。
在完成上述各項(xiàng)試驗(yàn)工作的同時(shí)，應(yīng)做好相應(yīng)的文件記錄等資料歸檔工作，每一臺(tái)儀器均應(yīng)有一套完整的檔案資料。
5、再確認(rèn)
為了確保儀器處于良好的使用狀態(tài)，對(duì)于一臺(tái)新購買的儀器在確認(rèn)工作結(jié)束以后，應(yīng)根據(jù)儀器的類別。確認(rèn)的經(jīng)驗(yàn)制定再確認(rèn)的計(jì)劃。
再確認(rèn)的時(shí)間間隔和內(nèi)容要根據(jù)儀器類別和使用情況決定，一般是3個(gè)月、6個(gè)月或1年。
儀器再確認(rèn)的內(nèi)容通常包括線路連接、附件備品消耗檢查、清潔工作、功能試驗(yàn)、工作日記等，其中重點(diǎn)安裝確認(rèn)中的功能試驗(yàn)。
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檢驗(yàn)方法的適用性驗(yàn)證
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藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)的檢測要求。
在起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證：在藥物生產(chǎn)方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗(yàn)證。
方法驗(yàn)證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草或修訂說明中。
根據(jù)《中國藥典》附錄XIXA的原則要求，檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證可分為三種情況處理；
1、無需驗(yàn)證的方法。
如藥典(包括USP、EP、CP、JP等各國藥典)的方法，一般只做系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)系統(tǒng)是否符合要求(主要指儀器穩(wěn)定性及柱的分離度是否達(dá)標(biāo))。
2、對(duì)比法。
已在參比實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證過的分析方法，可用對(duì)比試驗(yàn)的方法來確認(rèn)方法的可靠性，即將本實(shí)驗(yàn)室與參比實(shí)驗(yàn)室用同一方法對(duì)同批樣品所測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(如至少取五個(gè)批號(hào)，每批重復(fù)測定五次)，判斷方法在本實(shí)驗(yàn)室的可行性。
如有差異需查明原因或設(shè)計(jì)方案，對(duì)方法進(jìn)行再驗(yàn)證。
3、需進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證的方法。
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檢驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)及批準(zhǔn)
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安裝確認(rèn)及適用性試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)將試驗(yàn)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行匯總分析。對(duì)檢驗(yàn)方法作出正確的評(píng)價(jià)，驗(yàn)證報(bào)告的說明及結(jié)論部分應(yīng)簡明扼要。
試驗(yàn)中的主要偏差應(yīng)有適當(dāng)解釋。然后，報(bào)主管領(lǐng)導(dǎo)審批。檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的最終產(chǎn)物是一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的方法—根據(jù)驗(yàn)證的結(jié)果制訂的由有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法。
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檢出限的詳細(xì)計(jì)算
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在如何正確或準(zhǔn)確地估算檢出限的問題上,國際分析界一直存有爭議。檢出限的特殊意義在于可以對(duì)一個(gè)給定的分析方法在低濃度水平的檢測能力進(jìn)行準(zhǔn)確地評(píng)估，而考察一個(gè)分析方法在低濃度范圍的檢測性能，可以基于不同的角度或不同的側(cè)重點(diǎn),如可以從最小信號(hào)值與儀器噪音之比來考察，從方法測定空白的平均波動(dòng)性來統(tǒng)計(jì)估算,也可以根據(jù)分析方法校準(zhǔn)曲線的偏差特性來定量估算等等。
檢出限是評(píng)價(jià)一個(gè)分析方法及測試儀器性能的重要指標(biāo),所謂“檢出"是指ding性檢出，即判定樣品中存在有濃度高于空白的待測物質(zhì)。
ACS(美國化學(xué)學(xué)會(huì))對(duì)這一定義作了更簡明的概括：檢出限是一個(gè)分析方法能夠可靠地檢測出被分析物的zui低濃度。
1、檢測限（limit of detection, LOD）定義:
在樣品中能檢出的被測組分的zui低濃度（量）稱為檢測限，即產(chǎn)生信號(hào)（峰高）為基線噪音標(biāo)準(zhǔn)差k倍時(shí)的樣品濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時(shí)的濃度，對(duì)其測定的準(zhǔn)確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測限定義為信噪比（S/N）3:1時(shí)的濃度。
2、計(jì)算公式為：
D=3N/S （1）
式中：
N——噪音;
S——檢測器靈敏度；
D——檢測限
而靈敏度的計(jì)算公式為：
S=I/Q （2）
式中：
S——靈敏度；
I——信號(hào)響應(yīng)值；
Q——進(jìn)樣量
將式（1）和式（2）合并，得到下式：
D=3N×Q/I (3)
式中：
Q——進(jìn)樣量；
N——噪音；
I——信號(hào)響應(yīng)值。
I/N即為該進(jìn)樣量下的信噪比（S/N），該信噪比可通過工作站對(duì)圖譜進(jìn)行自動(dòng)分析獲得，一般的色譜或質(zhì)譜工作站都可進(jìn)行信噪比分析計(jì)算。這樣檢測限的計(jì)算方法就變得非常方便了。
3、計(jì)算方法：
實(shí)際計(jì)算時(shí)，檢出限有2種表示方法：一種是進(jìn)樣瓶中樣品檢測限，一種是針對(duì)原始樣品的方法檢出限。
A、對(duì)第一種檢測限，只要知道進(jìn)樣量和信噪比即可計(jì)算。如進(jìn)樣瓶中樣品濃度為1 mg/L,在此濃度下的信噪比為300(由工作站分析獲得)，則其檢測限為：
D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L
也可用絕對(duì)進(jìn)樣量表示，若進(jìn)樣體積為10 ul，則其檢測限為：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。
B、對(duì)第二種表示方法，需同時(shí)考慮原始樣品的取樣量和提取樣品的定容體積。仍按前述樣品計(jì)算，若取樣量為5克，最后定容體積為5 mL，則方法檢測限為：
D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg
即當(dāng)原始樣品中待檢物質(zhì)的濃度為0.01mg/kg時(shí)，若取樣量為5g,樣品經(jīng)前處理后定容體積為5mL時(shí),進(jìn)樣瓶中樣品的濃度可達(dá)0.01mg/L（假定回收率為100%）,此時(shí)，在其它給定的分析條件下，能產(chǎn)生3倍噪聲強(qiáng)度的信號(hào)。在實(shí)際檢測工作中，第二種表示方法更為常見。
4、注意事項(xiàng)
由式（3）可見，信噪比的大小直接關(guān)系到檢測限的大小。信噪比計(jì)算方法的不同，其比值大小有很大不同，這與計(jì)算信噪比時(shí)基線噪聲峰值的定義方式有關(guān)，一般有三種不同的定義：
A、峰/峰（peak to peak）信噪比，用某一段基線噪聲的平均高度；
B、峰/半峰（half peak to peak）信噪比, 用某一段基線噪聲平均高度的1/2；
C、均方根（RMS）信噪比，用某一段基線噪聲的均方根值計(jì)算。
除此之外，信噪比的計(jì)算結(jié)果還和所取噪聲的位置有很大關(guān)系，取信號(hào)哪一側(cè)基線的噪聲，取多長一段基線上的噪聲，計(jì)算結(jié)果都很不*相同，有時(shí)相差甚遠(yuǎn)。一般多取樣品峰兩側(cè)的噪聲峰值計(jì)算。
5、檢出限的確定
A、《全球環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)水監(jiān)測操作指南》中規(guī)定：給定置信水平為95%時(shí)，樣品測定值與零濃度樣品的測定值有顯著性差異即為檢出限：
L = 4.6Sb
式中：
L——方法的最di檢出濃度。
Sb ——測定次數(shù)為n次的空白平行測定（批內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)差（重復(fù)測定20次以上）。
B、國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）規(guī)定對(duì)各種光學(xué)分析方法，可用下式計(jì)算：
L = KSb/S
L——方法的zui低檢出濃度
Sb——空白多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（吸光度）；
S ——方法的靈敏度（即校準(zhǔn)曲線的斜率）
為了評(píng)估 ，空白測定次數(shù)必須足夠多，最好能測20次。國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)極力提倡取k值為3，一般來說，取相應(yīng)的置信水平大約為90%。
若L=0，并不意味著 ，或檢出限無限小。這時(shí)需配制一個(gè)濃度略大于零濃度的試樣系列（能產(chǎn)生一個(gè)可測信號(hào)值）代替全程序空白試驗(yàn)，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，用來代替 。
此外，有時(shí)為了工作方便和便于比較，也規(guī)定一個(gè)大家能接受的信號(hào)值作為檢出限，如分光光度法中，規(guī)定吸光度為0.010所對(duì)應(yīng)的濃度即為檢出限L。
C、 美國EPA SW—846規(guī)定方法中的檢出限為：L=3.143Sb
D、某些分光光度法是以吸光度（扣除空白）為0.010相對(duì)應(yīng)的濃度值或絕對(duì)量為檢出限，這是一種實(shí)驗(yàn)室間的協(xié)定方案。
E、氣相色譜法：檢測器恰能產(chǎn)生與噪音相區(qū)別的響應(yīng)信號(hào)時(shí)所需進(jìn)入色譜的物質(zhì)最小量為檢出限，一般為噪音的二倍。
F、離子選擇電極法：當(dāng)校準(zhǔn)曲線的直線部分外延的延長線與通過空白電位且平行于濃度軸的直線相交時(shí)，其交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度值即為該離子色譜所對(duì)電極法的檢出限。
由測得的空白值計(jì)算出的L值不應(yīng)大于分析方法規(guī)定的zui低檢出濃度值，如大于方法規(guī)定值時(shí)，必須尋找原因降低空白值，重新測定計(jì)算至合格。
6、校正曲線繪制：
A、按分析方法步驟，通過實(shí)測濃度和儀器信號(hào)值的直線關(guān)系，確定實(shí)驗(yàn)室條件下的測定上限。當(dāng)測定上限低于方法的檢測上*，只能用實(shí)測的直線范圍。
B、繪制校正曲線的分析步驟應(yīng)與樣品分析相同，并且不少于5個(gè)濃度值。
C、校正曲線繪制與每批測定樣品同時(shí)進(jìn)行，對(duì)某些分析方法的校正曲線的斜率穩(wěn)定，批間誤差較小，使用原制校正曲線時(shí)，應(yīng)與樣品同時(shí)測定2份中等濃度標(biāo)樣和2份空白的平行樣。
測得標(biāo)準(zhǔn)的濃度（減去空白）值與原校正曲線相對(duì)應(yīng)的濃度值的相對(duì)偏差，分光光度應(yīng)小于5%；原子吸收法應(yīng)小于10%，否則重新制作校正曲線。
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